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盡管譜系節點(diǎn)細胞在再生醫學(xué)中的應用前景廣闊，但基于傳統人為操作獲取譜系細胞單克隆的方法需要消耗大量時(shí)間和勞動(dòng)力，獲取效率通常比較低，且無(wú)法以無(wú)標記、無(wú)酶活反應參與、非侵入式的方式獲取譜系細胞單克隆。此外，利用微流控技術(shù)雖然可以提高譜系細胞收獲效率，但這種方法無(wú)法獲得基于譜系特異性的細胞單克隆。因此，發(fā)展能夠高效富集譜系細胞單克隆的自動(dòng)化整機技術(shù)顯得尤為重要。由于細胞-細胞/細胞-基質(zhì)之間的粘附力變化是譜系細胞命運變化中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節，通過(guò)調節流體剪切力大小可以實(shí)現以無(wú)標記、無(wú)酶活反應參與、非侵入式的方式分離/選擇具有不同粘附特性的譜系細胞單克隆，因此這種策略可以應用于基于細胞類(lèi)型特異性的單克隆工程化獲取。

近日，中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院（廣州健康院）張驍研究員團隊提出一種基于結構微流體創(chuàng )新的譜系細胞單克隆自動(dòng)化獲取策略，以無(wú)標記、無(wú)酶活反應參與、非侵入式的方式，在體細胞重編程過(guò)程出現的復雜譜系中實(shí)現了對特定譜系的單克隆性細胞的自動(dòng)化獲取，并研發(fā)出基于結構微流體的細胞單克隆獲取整機技術(shù)（圖1）。該原創(chuàng )性策略被部署于廣州健康院前期自主研發(fā)的自動(dòng)化干細胞誘導培養裝備，提高了人誘導多能干細胞（hiPSCs）單克隆的獲取效率與純度，提升了系統魯棒性（robustness）及縮短了體細胞重編程后持續純化hiPSCs（sub-cloning）的建系周期。相關(guān)研究成果以“Selecting Monoclonal Cell Lineages from Somatic Reprogramming Using Robotic-Based Spatial-Restricting Structured Flow”為題在國際權威學(xué)術(shù)期刊?Research?上在線(xiàn)發(fā)表。

在研究中，研究人員通過(guò)分析不同體細胞重編程過(guò)程中細胞粘附分子的表達水平變化情況，發(fā)現細胞多能性基因的表達水平與Integrin家族基因的表達量呈負相關(guān)性，而與Cadherin家族基因的表達量呈正相關(guān)性。由于Integrins是細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）相互作用的關(guān)鍵粘附分子，而Cadherins是細胞與細胞之間相互連接的重要分子，這意味著(zhù)體細胞重編程轉變成多能干細胞這一譜系命運變化過(guò)程中，細胞與ECM的連接可能會(huì )減弱，而細胞與細胞之間的連接可能會(huì )增強。為了證明這個(gè)假設，作者提出進(jìn)一步通過(guò)設計平行平板流動(dòng)腔實(shí)驗和免疫熒光實(shí)驗來(lái)進(jìn)行驗證。實(shí)驗結果與預期假設相一致，并且平行平板流動(dòng)腔實(shí)驗初步證明了流體剪切力有望成為分離/選擇特定類(lèi)型粘附細胞的好技術(shù)路徑。

隨后，作者基于流體動(dòng)力學(xué)原理設計了以可以產(chǎn)生局部結構微流體的細胞獲取微型挑針結構（PTMS），機械團隊克服了流場(chǎng)效果與多曲面加工實(shí)現的難題，反復校驗加工結構，最終基于PTMS產(chǎn)生的結構微流體（PTMS-FLOW）實(shí)現了對基于空間限位譜系細胞的特異性挑取。此外，研究證明了PTMS-FLOW可根據流速變化在Z軸-h0的為常量的條件下，應對不同細胞類(lèi)型的粘附力差異，實(shí)現以無(wú)標記、無(wú)酶活反應參與、非侵入式、和非接觸的方式對不同譜系細胞進(jìn)行特異性的選擇。該研究證明了結構微流體是作為分離/選擇特定譜系類(lèi)型粘附細胞的可自動(dòng)化的技術(shù)路徑，為后續進(jìn)一步研究譜系細胞單克隆的自動(dòng)化獲取提供了理論基礎（圖2）。

為了將上述策略應用于對體細胞重編程過(guò)程中特定譜系的細胞的自動(dòng)化獲取，作者團隊通過(guò)克服機械模塊控制和精準調度的難題，結合細胞光學(xué)成像和自適應算法，實(shí)現精準操控微結構的功能底部與細胞單克隆之間的Z軸間距和水平位移，從而確保精準操控PTMS-FLOW作用于單克隆性的譜系細胞上，以此實(shí)現在體細胞重編程過(guò)程出現的復雜譜系中快速獲取hiPSCs細胞單克隆的目標。

此外，作者團隊借助自動(dòng)化整機技術(shù)的精確的流體操控能力，設計了一種雙挑模式（Dual?Run?Selection），通過(guò)使用兩次不同強度的剪切流體分別獲取不同類(lèi)型粘附特性的譜系細胞，實(shí)現了對特定空間位置的hiPSCs譜系細胞單克隆的特異性選擇（圖3），并能為下游hiPSCs實(shí)現特異性擴增提供純化（sub-cloning）能力。

該研究建立的整機技術(shù)通過(guò)大幅減少譜系細胞生成過(guò)程中的時(shí)間成本，以及人工操作量，使得譜系細胞獲取和培養起來(lái)更簡(jiǎn)單。該研究為自動(dòng)化生產(chǎn)特定譜系細胞用于臨床干預提供了新的技術(shù)方案，并為再生醫學(xué)基礎研究提供更多自動(dòng)化獲取譜系細胞的工具，從而從技術(shù)手段和方法學(xué)方面促進(jìn)再生醫學(xué)領(lǐng)域的基礎研究和應用落地。

廣州健康院陳學(xué)平博士、樊科高級工程師、盧俊高級工程師、張晟博士、董建華高級工程師及秦季生工程師為該論文的共同第一作者。廣州健康院張驍研究員為該論文的唯一通訊作者。該研究得到了中國科學(xué)院、廣東省科技計劃、廣州市科技計劃等項目的支持。

論文鏈接

圖1. 譜系細胞自動(dòng)化獲取策略整機技術(shù)概要

圖2. 基于空間定位的結構微流體研究不同譜系細胞的粘附分離作用

圖3 基于譜系細胞粘附力的差異，應用PTMS-FLOW實(shí)現了對重編程多能干細胞單克隆的選擇